纯化抗体效价测定法

作者:李成文(原北京军事医学科学院主任)

1当抗体浓度在5mg/ml以上,可用免疫双相扩散法测定抗体效价。

    2当抗体浓度低于3mg/ml时,或者对应抗原为小分子(如生物素,地高辛等)时必须用ELISA法测定抗体活性,同上步骤。

操作步骤如下:

11%离子琼脂配制及倒板:

    1g琼脂糖或日本琼脂粉,加入100ml 0.05U pH8.6巴比妥-HCL缓冲液中,水浴下加热至完全融化,取3ml倒在普通载玻片上(2.5×7cm,待凝胶凝固后,放4℃存放20min以上可打孔使用。

    待用琼脂凝胶加入20mg NaN3,混匀后3ml-分装于4℃保存备用。

2、打孔加样。

    3mm打孔器打孔,孔径3mm,孔距35mm的梅花瓣孔图。注意不要把孔打裂,及漏底现象。

    当测抗体效价或活性时,抗体对倍稀释后加在四周孔,抗原加在中间孔,每孔10μl

    各种IgG抗体,对应抗原可用正常血清1:4050PBS稀释作抗原。

3、结果观察

加好样品的双扩板,放37℃温箱2448小时,观察结果,**对着日光灯观察。**稀

释度抗体孔的沉淀线为抗体效价或活性。

琼脂双相扩散图.png

琼脂双相扩散图

沉淀线随着抗体的稀释,逐渐靠近抗体孔边。

(五)单相免疫扩散法:参考现代免疫化学技术185187

(六)免疫电泳法:参考现代免疫化学技术5262

(七)免疫印迹技术参考现代免疫化学技术8387页。

(八)纯化抗体及免疫球蛋白IgG 的定量均采用紫外吸收公式计算   


                                                       IgG(或纯化抗体IgG)mg/ml=×稀释倍数


IgG消光系数=1cm光程,1mg/ml浓度0.01mol/L pH7.2PBSOD吸收值。

   

不同血清IgG的消光系数为:羊IgG1.30,IgG1.35,IgG1.38,小鼠IgG1.46,

大鼠IgG1.45,IgG1.50,IgG1.42,IgG1.58,IgG1.77