单向免疫扩散

作者:李成文(原北京军事医学科学院主任)

【基本原理】

    制备成含有一定浓度抗血清(或一定量抗体)琼脂凝胶板(抗体 固定不动)。打孔加入不同稀释度的抗原量。进行免疫扩散(在板上抗原量 呈 放射状扩散),抗原与相应抗体在浓度合适时,则形成清晰的沉淀环,其直径大小与所加抗原量成正比。将已知参考抗原形成的沉淀环绘成曲线,然后以待测标本的沉淀环直径查标准曲线,计算 其 被测 抗原的含量。


    【操作方法】

    1、制备2%的琼脂凝胶板,用0.05μ pH8.6巴比妥缓冲液将琼脂或琼脂 糖配成2%离子凝胶,沸水浴化后分装待用。加入0.01%NaN3,4℃保存。

    2、选择好合适的抗体滴度,(以即省抗血清又能合适测出抗原 量),用0.05μ pH8.6巴比妥缓冲液将抗血清作最终稀释度的二分之一倍稀释,取一定体积50℃予热1分钟,等体积的同已融化好(降至50℃-56℃)的2%琼脂凝胶混合,倒成所需大小的抗体凝胶板。

    3、打孔加样。一般将板打成孔直径为3mm、孔距为10mm(两孔中心距离)的胶孔。

    注意打孔要垂直不要裂开。用生理盐水将样品适当稀释后每孔准确加入10u1。在样品测定前首先制作标准抗原或参考抗原的标准曲线,参考血清标有国际单位/毫升或毫克/毫升。用生理盐水将参考血清按需要倍数稀释。然后定量加入胶孔。

    待测标本,根据样品种类不同分 别作不 同倍数稀释。一般IgG 1:50,IgA1∶10, IgM1∶4稀释。

    4、扩散,加样后放在湿室内(如平皿里),37℃温箱扩 散,IgG可过夜至24小时, IgA、IgM 48小时。

    5、绘制标准曲线,扩散结束,量取沉淀环的大小,以不同浓度的抗原为横座标,以沉淀环直径为纵座标在座标纸上作图,制成单向免疫扩散标准曲线。

    6、单向扩散中实验条件的选择

        (1) 抗体合适稀释度选择,固定抗原浓度,用巴比妥缓冲液将抗血清倍比稀释分别制成离子琼脂抗体板,观察不同稀释度抗血清板上抗原沉淀环大小及清晰度,以确定抗血清的稀释度。

        (2) 抗原稀释度选择,固定抗血清浓度,将抗原作倍比稀释(要有总蛋白及抗原蛋白含量),然后分别扩散,决定合适的稀释范围。

应注意的,当板上抗体量越高,抗原可以越浓,且沉淀环出现的快。

        (3) 扩散环动态曲线制作,固定板上抗体浓度、取不同稀释度的各种抗原,连续观察其沉淀环的增大情况,一般可间隔1小时1次。直至沉淀环不再增大为止,以不同时间为横座标,以沉淀环直径为纵座标作图,从而确定抗原扩散环的终止时间。

        (4) 结果处理与保存,观察后沉淀环如长期保存可按 免 疫 电 泳沉淀线的相应处理办法。


        附注:

    目前我国的IgG、IgA和IgM参考标准品,是按照世界卫生组织所颁发的67/86制品标准化的。

   

    我国正常Ig含量为

    IgG、12.0±2.62mg/ml,相当1501μ/ml

    IgA、2.00±0.5mg/ml,相当1410μ/ml

    IgM、1.10±0.3mg/ml,相当1301μ/ml

   

     国际单位与重量换算:

     IgG1个国际单位(μ)=80.40μg

     IgA1个国际单位(μ)=14.20μg

     IgM1个国际单位(u)=8.47μg