逆向琼脂凝胶扩散抗体定量法

作者:李成文(原北京军事医学科学院主任)

逆单向琼脂凝胶抗体定量法,是一项七十年代建立的新技术。此法简单易行,特异灵敏。目前,国际上主要用于抗血清制品、荧光抗体及酶标记抗体等抗体蛋白量的测定等。


    【 原   理 】

    将一定浓度,通常为每毫升离子琼脂凝胶含有10~20微克的抗原IgG,(或其它蛋白性质抗原)固定于琼脂凝胶骨架中,打孔加入一定体积的抗体,在一定浓度盐离子参与下,扩散中与抗原起沉淀反应,而形成沉淀环,且沉淀环的大小和抗体含量的对数成直线关系。


    【 材   料 】

    1、正常人IgG,兔抗人IgG亲合层析IgG,兔抗人血清IgG。

    2、日本琼脂粉(进口分装)或琼脂糖粉。

    3、0.12μ pH8.6巴比妥-HC1缓冲液。

    巴比妥钠20.8克,用馏水溶至964.6ml,1%NaN,10ml,1N HC1 25.4ml混匀备用。

    4、0.2%噻嗪红染液:0.2克噻嗪红溶于 100ml5% 乙 酸中。或用 0.05%氨基黑10B染液,氨基黑10B0.5克,1M乙酸500ml,0.1M乙醋钠500ml


    【操作方法】

     1、抗原免疫板的制备

        (1) 2%离子琼脂凝胶制备

        取pH8.6,0.12u巴比妥缓冲液,制成2%离子琼脂凝胶,水浴保温,根据需要分装,或4℃冰箱保存备用。

        (2) 抗原免疫板的制备

取2ml融化好的2%离子琼脂凝胶于50℃,15-20秒内同2mlIgG抗原(其浓度为有活性IgG蛋白20μg,用0.12μ pH8.6巴比妥缓冲液 稀释)水浴中充分混匀。(约20秒右右,注意尽量少起气泡)立即在水平板上倒成 2.5x7cm的胶板。室 温冷凝10分钟后,用孔距为15mm,直径为3mm的打孔器打孔,要求打孔垂直和边缘整齐。

      2、加样扩散及测量

          被测样品用0.06μ pH8.6巴比妥缓 冲液适当稀释后,用微 量注 射 器每孔加入10ul,湿室37℃,扩散24小时后用Wooton的沉淀环读数尺测量沉淀环直径的大小。见图44

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        如果沉淀环不太园时,可量其三个读数求出平均数,再于逆向扩散抗体标准曲线上查出相应的抗体含量,即为被测样品的抗体蛋白量。

如沉淀环不够清楚,可用生理盐水洗蛋白一小时,再 用1%鞣酸处 理15分钟,可提高清晰度,易于测量。

      3、抗体IgG逆向扩散标准曲线制作

           取纯化后标定抗原量的IgG及亲合层析纯化抗体IgG,先固定抗原量,测定出不同抗体量形成沉淀环的关系后,可采取一定范围内抗体量作成沉淀环。然后,以沉淀环直径为横座标,以抗体量为纵座标在半对数座标纸上作图。根据我们作情况,作 出抗人IgG的标曲线,抗体量以400-800微克为宜,沉淀环直径在5.5-7.5mm 易观察和易测量。抗体 IgG逆相扩散标准曲线见图45。

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      4、染色及结果保存

           形成之抗体沉淀环,如果提高灵敏度或为了保存结果,可将形成的沉淀环的琼脂凝胶板浸泡于生理盐水中1一2天,彻底脱净沉淀环以外的蛋白质(非抗原抗体复合蛋白),用0.2%噻嗪红室温染色20分钟,再用7%乙酸脱去琼脂板的背景颜色,将琼脂凝胶板移至干净玻片上,或白色相纸上,用滤纸把样品孔的水分吸去,滴上5%的甘油,再用一张滤纸盖上,放37℃温箱过夜或室温干燥,即成**保存结果。