FITC标记抗体法

免疫学早已证实各种抗血清的主要抗体部分是IgG，因而，一般制备荧光抗 体，则都采用标记抗休IgG成分。目前,较为广泛使用的异硫氰酸荧光素(FITC)标记导书有两种方。法，即直接标记和间接标记法，其标记的步骤包括:抗体IgG的纯化，FITC标记、标记抗体的纯化及鉴定等。

    标记原理

    在碱性条件下，异硫氰酸荧光素(FITC)的硫氰基在水溶液中与免疫蛋白的自由氨基(如赖氨酸的e一氨基等)经碳酰胺化而形成硫碳氨基键，成为标记免疫球 蛋白，即荧光抗体。一个IgG分子上最多能标记15-20个FITC分子。

反应式如下:

材料和试剂：

    1、抗血清如兔抗人IgG抗血清。

    2、异硫氰酸荧光素,硫酸铵,DEAE-纤维素,SephadexG-50中等颗粒,琼脂糖透析袋，层析柱直径2厘米，长30厘米,电磁搅拌器等。

    3、0.01MPH7.1磷酸盐缓冲盐水(P、B、S)NaHzPO2HO3.9克，Na，HPO10克，NaC185克，蒸馏水溶至10,000毫升。

4、0.01M PH7.4P·B。

    (1)   0.01M KH₂PO,2.72克，溶于2000毫升H₂O中。

    (2)   0.01M Na₂HPO₄ 5.64克，溶于4000毫升H₂O中。取(1)液1050毫升， (2)液3950毫升混合为5000毫升。

    5、0.5M PH9.5碳酸盐缓冲液(直标记法)。

    (1) 5.5%Na₂CO₃

   (2) 4.2%NaHCO_3，取(1) 液5.8毫升和(2) 液10毫升混合后使用。

6、0.025M PH9.0碳酸盐缓冲液(间接标记用)

(1)   Na₂CO₃，2.12克溶解在1000毫升H₂O中。

    (2)   NaHCO₃ 16.8克溶于1000毫升中。

    取(1)液4毫升，(2)液46ml，再加入33毫升H₂O混合后备用。

方法:

1、抗体IgG的纯化：

   (1) 兔血清抗体IgG的纯化，多采用DEAE纤维素批量法吸附杂蛋白纯化IgG的方法。

   (2) 羊或马血清抗体IgG的纯化，一般采用硫酸铵50%，33%分步盐析，再 经DEA一纤维素层析纯化。 (详见后面介绍)

2、异硫氰酸荧光素标记IgG：

    (1) 直接标记法（称热标法）

       ① 以0.01M PH7.1PBS调整蛋白浓度到20毫克/毫升放于称量瓶中。

② 取相当于蛋白量1/100的FITC，溶解于相当蛋白溶液1/10体积的0.5M，PH9.5碳酸盐缓冲液。

       ③ 在搅拌下，将FITC缓慢地加入IgG蛋白液内，室温20℃左右，磁力拌搅标 记4小时(要尽量避免产生泡沫，注意标记中密闭进行，以保证在PH9.0以上条件标记)。

       ④ 将标记溶液对10-50倍P·B·S透析2-4小时，以利于下一步用凝胶过滤法过滤去除游离FITC，有时也可不透析直接上柱。

    (2) 间接标记法（也称半透膜渗析低温标记法）

称取相当蛋白量C，即20毫克，溶于10倍蛋白液体积即200毫升的0.025M PH9.5碳酸盐缓冲液于烧杯中。将20毫升蛋白液装入透析袋内，三端扎紧，放入上述FITC溶液里，4℃磁力搅拌标记12-18小时。

    荧光抗体的两种标记方法，根据各实验室的经验和习惯，采用上述两种方法均能获得良好制品。

3、标记IgG的纯化

    (1) SephadexG-50凝胶过滤去除游离FITC

      柱子：2x30厘米玻璃层析柱，柱内底部垫一层尼龙绢,内装充分溶胀和排气的G-50凝胶，床体积为80毫升。

      洗脱液： 0.01M PH7.1 P.B.S.

      流速：0.1-1毫升/分。

      加样量：凝胶柱床体积的10%-15%加样。

      当样品加入柱中后，随着洗脱液的流动，样品在柱中被分离成三个区带，柱上部荧光区带为结合FITC较强的蛋白及游离FITC。中部为无色的洗脱 液，柱下部为FITC标记 IgG，收集这部分即是标记IgG，一般样品过滤后约稀1倍左右。

       当标记IgG收集完后，继续洗脱，直至柱上的色带洗净，柱子即再生。

(2) DEAE一纤维素(DE~32)柱层析纯化标记IgG

       柱子：同上要求，内装充分溶胀及平衡的纤维素(根据需要装柱床大小)。

       洗液： 0.01M PH7.1 P.B.S。

       流速：1毫升/分。

       加样量：可根据纤维素的蛋白吸附溶量计算。如DE~11干纤维素1克吸附130毫克蛋白，DE~32干纤维素1克可吸附蛋白660毫克等(对分子量68000的BSA)。

       洗脱时，将柱子**个色带(标记IgG)洗脱完毕为止。可分管收集。将荧光素 强弱部分分别合并后，准备分析鉴定。

4、标记IgG的鉴定（以制兔或羊抗人IgG荧光血清的鉴定为例）

   (1) F/P比值测定

      F代表荧光色素FITC,P代表蛋白,F/P比值反应试剂的光学敏感性,测定与计算如下：

      ① 总抗体蛋白量(P)测定。同前蛋白质的紫外光280nm或 改良Folin法。但利用紫外光测定蛋白含量时，应当减去FITC在280nm相应含量的吸收值。见FITC 280吸 收标准曲线图。

      ② 总FITC量的测定：可用分光光度计测定其标记IgG液的495nm光密度值再去查FITC，495nm吸收的标准曲线。

    ③ F/P的计算

    通常采用F/P克分子比，可按下列公示计算：

或者利用 F495O.D，P280，O.D二值在FITC标记物中球蛋白，荧 光素和F/P计算图，直接查出。

    一般要求标记IgG荧光血清,总蛋白量有5mg/ml以上,其抗体含量要在1mg/ml以上, F/P克分子比在1-5为合适。用于细菌的荧光抗体可高标到F/PM为1-10范围。

    （2）染色体单位测定(即抗体蛋白的含量)

     微量标准琼脂双相扩散法，其操作如下:

      ① 用PH8.6，0.05μ，巴比妥缓冲液将日本琼脂粉配成1%离子琼脂，将4ml凝 胶倾注于载玻片上，7.5x2.5cm。

      ② 用打孔器将凝胶打成梅花辨六孔，孔径为3mm，孔距为5mm，每孔约加样10u1(微升)，中孔加抗原“1mg/ml的IgG”，用巴比妥缓冲液将标记IgG液对倍稀释后，即原液，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，加入四周孔里。

      ③ 37℃,温箱24小时观察结果,出现沉淀线的最高稀释解度作为染色单位值。如抗体沉淀效价为1∶8，则每毫升含有8个单位。据统计，一个染色单位约相当于0.25mg标记抗体蛋白，对标记抗体液不低于4个单位，或抗体蛋白量1mg/ml以上，**在16单位以上。

如果测定抗人IgG荧光抗体含量，也可直接逆相扩散法进行抗体定量。

（3）特异性染色试验

     特异性染色试验是采用间接双层荧光染色法，以鼠胃、肾、肝冰冻切片为抗原，已知抗核抗体或抗平滑肌抗体阳性的病人血清，再用标记好羊抗人IgG或抗兔人IgG荧光血清染色，结果为阳性(++)为效果良好。

    （4）非特异染色试验

     用P.B.S将标记IgG或IgM荧光血清作系列对倍稀释代替**血清，作荧光染色，其结果为阴性，且背景非特异荧光较弱的稀释度，作为使用的非特异染色滴度。

     （5）工作稀释度测定（即特异性染色滴度）

      采用P、B、S将荧光血清和已知抗核抗体阳性血清对倍稀释，即从原液,1∶2，1∶4。1:8，1∶16等进行间接法棋盘交叉染色观察，以“++”荧光亮度为判断标 准，选 择其该荧光血清的工作稀释度。染色后结果可以下表为例，见表10。

      从下表中结果该荧光血清的工作稀释度可选择1：4~1∶8使用。

（6）标记IgG的纯度鉴定

   表10   羊抗人IgG（或IgM）和抗核抗体（阳性）血清交叉染色结果

    用聚丙烯胺凝胶园盘分析电泳鉴定标记IgG的纯度，所用的方法为单层分离胶，化学聚合，装胶玻管6mm内径，长8cm左右，每只约要2.3-2.5ml胶，每只胶管维持3-5mA电流，电泳60左右分钟，脱胶后用马斯克兰G-250染液染色。

    加样量10微升内有100ug总蛋白量即可分析，所标记IgG蛋白为一扩散色带，有 时其上有一染色较深的蛋白带。详见电泳技术部分。