异硫氰酸四乙基罗丹明荧光素的标记

原理:

    异硫氰酸四乙基罗丹明(RnodamineRIsothiocyhate)简写RBITC，呈粉红色或褐色粉沫，在水溶液中微溶，易溶于乙醇，丙酮和二甲替甲酰胺等有机溶剂。罗丹 明**吸收光谱为560nm，**发射光谱600nm，特异性荧光呈桔红色。罗丹明素在碱性条件下其异硫氰酸基与免疫球蛋白分子游离的赖氨酸ε一氨基，形成硫胺键,其结合反应式如下:

     器材:

一般玻璃器材，玻璃层析柱(直径2厘米，长30及15厘米各一支)，尼龙纱布两小块，滤纸，支持架，剪刀，磁力搅拌器一台，离心机一台，免疫球蛋白、异硫氰酸四乙基罗丹明，SephadexG50凝胶10克，DEAE一纤维素5-10克，二甲替甲酰胺，0.2MNa₂HPO₄ ，0.1N NaOH，0.005MPBS(0.1M NaC1) PH7.2。

方法:

    0.005M PBS的配制:

          0.1M   NaH₂PO₄        1份

          0.1M   Na₂HPO₄         2份

                     H₂O                 17份

使用前加NaCl使成0.1M NaC1液

标记步骤如下:

    标记异硫氰酸四乙基罗丹明时使用蛋白质浓度应稍低于异硫氰酸荧光素FITC标记中的蛋白浓度。RBITC的使用剂量则高于FITC的使用，可根 据其纯度在1/20-1/40之间选择。

    (1) 取纯化的抗体球蛋白IgG，用0.005M PBS平衡配制成2%浓度。

    (2) 加入0.2M NazHPO,溶液，占蛋白体积的1/4使PH至8.0左右，在磁力搅拌器下混合。

    (3) 按球蛋白的总重量的1/40-1/20称取RBITC放在瓶内，加入蛋白质总体积1/20的二甲基替甲酰胺,使其全部溶解在磁力搅拌下一滴滴加入球蛋白中,在此时用0.1N NaOH调PH使其维持9.0-9.5之间。

    (4) 在室温中(20-30℃)搅拌1-2小时，4℃则需搅拌20小时以上。

(5) 将标记物3000r/分10-15分钟离心去除沉淀物。

    (6) 将上述样品通过SephaexG50柱去除未结合的游离的RBITC，收集洗脱 **峰即RBITC与抗体球蛋白的结合物。   

    (7) 将收集的结合物通过 DEAE一纤维素，用0.05M PBS洗脱，收集洗脱部 分即为纯化的荧光抗体结合物。

    (8) 对收集荧光抗体的染色效价进行测定，取2-4个染色单位进行使用。同时测定 RBITC/P的比值，一般在1-2x10-之间效果较好。。

结果判断及注意事项:

    (1) 染色前标本在荧光显微下观察时，**使用落下光装置，这样可使荧光明显增强，激发光滤板波长为560nm。第二滤光器波长度为600nm。特异性荧光呈明亮的桔红色，背景为暗红色，视野下对比明显。

    (2) 在通过结合物之后的凝胶柱用PBS洗脱游离荧光素，如最后仍为基粉红色不易洗脱时可用0.1N Na0H 10-15ml加至柱内之后用PBS继续洗脱即可。

(3) 荧光术体需分装成小瓶包装，放20℃保存，防止多次冻融。长期保存时可低温干燥。