藻红蛋白标记抗体技术

作者:李成文(原北京军事医学科学院主任)

藻红蛋白标记抗体技术

(1) 藻红蛋白(Phycoertyhrin PE)标记抗体法

      a、巯基化PE的制备

600μl15.5mg/ml氯化 硫醇亚胺(Iminothiolane hydrochloride,sigma)加到1.2ml3.6mg/mlPE,在125mMPH6.8的磷酸钠中,室温90分钟后,对50mMPH6.8 P.B.4℃透析然后换PH7.5PB透析。每个PE分子中可结合8个巯基。

      bPE-IgG的制备

30ul1.1mg/mlSPDP(N-Succinimdy1 3-(2-pyridyldithio) propinate)(SPDP为异双功能试剂,分子式为

PE-IgG的制备.png

      国产的乙醇溶液,加入700μl4.2mg/ml IgG50mMPH7.5 P.B.溶液,室温反应2.5小时。(SPDPIgG的克分子比率为5.3),400μl1.7mg/ml的巯化PE同上缓冲液,加到500μl反应混合液中,室温反应12小时,加入100μl50mM碘乙酸钠封闭残余巯基,对PB4℃透析过夜。

(2) 藻红蛋白标记蛋白A

    0.5mi PE(4.08mg/ml)0.M PH7.4PB,含有0.1MNaCl10μ1 SPDP无水甲醇液(2.65mg/ml)SPDP/蛋白克分子比为1022℃反应5分钟,过SephadexG-50,(1x17cm),用100mM PH7.4PB含有0.1M NaCI平衡柱子,并洗下PE蛋白峰。

    0.5ml蛋白A2mg/ml100mMPB含有100mM NaC1PH7.42.6ul上述SPDP甲醇液,SPDP:蛋白液=9.522℃40分钟,加入25ul1M二硫苏糖醇(DTT)PH7.4缓冲液中,22℃25分钟,同上过SephadexG-25柱,收集蛋白A峰。

    活化PE:硫醇化蛋白A的克分子 比为1∶2, 取0.77mg/mlPE,和0.27mg/ml蛋白 A22℃,反应6小时,混合物4℃保存备用。

    以上两种PE标记制品,可最后配于0.01M PH7.4PB,含有0.1M EDTA1mM碘乙酰胺、1%BSA0.1%NaN3 ,0-5℃保存。

    附藻红蛋白的制备

取新鲜红藻(red algate)用蒸馏水洗净,悬50mMPH7.0PB中,组织匀浆器打3分钟,几层纱布过滤,离心去除小颗粒,上清液用60%饱和硫酸铵盐析,以上操 作4℃下进行,离心收集沉淀,重悬于60%(NH4)2SO4于50mM PH7.0PB,过DEAE-纤维素层析,用降低硫酸铵饱和度的PB溶液洗柱子,PE洗脱于

10%(NH4)₂SO4和200mM PH7.0 PB液中,经硫酸铵盐析浓缩,重溶于50mM PH7.0PB,加入(NH4)2SO4在10%饱和度,4℃可结晶出来。

文献:Vernon Tet al;JCell Biology 93,1982,P981-6.