【基本原理】
双向免疫扩散实验包括试管法和平板法,较常用的是平板法。该法是由 Ouchterlony(1948年)首先建立。故又称Ouchterlony法。它的基本原理是抗原(可溶性)和抗体在琼脂糖凝胶介质中,有一定PH和盐离子存在下,两者相向扩散,至相对应性抗原与抗体适合比例时,则可出现免疫沉淀线,根据沉淀线的种类及特点,从而去鉴别抗原或抗体的性质异同。
【方 法】
1、配制1%的PH8.6, 0.05μ巴比妥离子琼脂糖凝胶,沸水融化后分装待用,如暂时不用可加入 0.01%NaN3分装适量放4℃存放。
2、倒板,根据需要倒置适当大小的琼脂糖凝胶板。常用的是将2.5~4ml凝胶(温度降至50-55℃)倒于平放的普通载玻片制成(7.5×2.5cm)。室温放置15分钟,再放4℃ 10分钟后使用,所制好胶板如不当时用,可放平皿或其它密封湿容器中不长菌。
3、打孔,根据实验要求可打成各种孔大小的不同图形。常用的是孔径3 mm的梅花图形。不同打孔图形要求见图42。
4、加样扩散,如测抗体效价,应对倍稀释后分别加到梅花孔四周,抗原加在中心孔,且抗原如Ig**在100ug/ml浓度,或全血清稀释100倍作抗原。如检查抗原性质或纯度,可以上述浓度加到中心孔,四周分别加入不同种类抗血清。加样量3mm 孔约10pl,5mm孔约15ul。加样后湿室37℃扩散IgG5-12小时,IgA24小时以上,IgM要24-48小时方可扩散充分。
5、结果分析与保存,双向扩散出现沉淀线的位置及形状进行分析,主要有三种结果形式,即抗原性相同、不同或部分相同,相应沉淀线为融合、交叉,见图43。对于双向扩散沉淀线保存,其操作同免疫电泳的部分内容。
a相同抗原沉淀线融合,b相同抗原沉淀线融合,但两抗原浓度不同,e两抗原性完全不同,产 生交叉性沉淀线,d抗原部分相同,e两者互相都部分相同抗原。
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